Pewarnaan Gram

I.     PENDAHULUAN

A.    Latar Belakang

Satu tujuan setiap bidang ilmiah ialah organisasi dan interprestasi informasi faktual yang ditemukan dalam bidang tersebut. Demikian pula halnya dengan bidang ilmu mikrobiologi. Pemahaman mengenai mikroorganisme khususnya bakteri memiliki banyak karakter atau sifat yang dapat digunakan sebagai dasar pengelompokan. Salah satunya yaitu sifat fisiologis bakteri tersebut.

Sifat fisiologis bakteri merupakan sifat yang diekspresikan atas dasar fungsi dari suatu sel atau bagian dari sel tersebut. Sifat fisiologis tersebut dipengaruhi oleh struktur sel dari bakteri itu sendiri, oleh karena itu setiap bakteri yang memiliki struktur sel yang berbeda memiliki sifat fisiologis yang berbeda pula. Salah satu struktur sel bakteri yang menjadi faktor pembeda masing-masing kelompok bakteri adalah stuktur dinding sel. Struktur dinding sel bakteri tersusun atas lapisan peptidoglikan yang mampu menyerap zat warna. Berdasarkan komponen dinding sel yang memiliki kemampuannya untuk mengikat zat warna, maka bakteri dikelompokan menjadi dua kelompok besar yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif.

Bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif dapat dipelajari dan diketahui dengan melakukan proses pewarnaan Gram. Secara umum pewarnaan Gram melibatkan empat proses utama yaitu pewarnaan dengan zat warna utama yaitu kristal violet, pemberian zat pengikat, pencucian dan  perlakuan zat warna penutup. Berdasarkan latar belakang tersebut maka perlu dilakukan praktikum pewarnaan Gram.

B.     Rumusan Masalah

Rumusan masalah dalam praktikum ini adalah bagaimana metode pewarnaan Gram ?  

C.    Tujuan Praktikum

Tujuan yang ingin dicapai dari praktikum ini yaitu untuk mengetahui metode pewarnaan Gram.

D.    Manfaat Praktikum

Manfaat yang di dapat pada praktikum ini adalah dapat mengetahui metode pewarnaan Gram.

II.   TINJAUAN PUSTAKA

A.    Bakteri

Bakteri adalah mikroorganisme bersel satu, berkembang biak dengan pembelahan sel, hanya dapat dilihat dengan mikroskop. Bakteri tergolong kedalam prokariotik dengan diameter kurang lebih 0,2- 5 µm. Bakteri memiliki komponen sel yang tidak sempurna seperti organisme eukariotik, dan memiliki stuktur dinding sel yang tersusun dari lapisan peptidoglikan. Komponen dinding sel pada bakteri berbeda antara satu sama lain, sehingga bakteri dikelompokan berdasarkan kemampuan dinding selnya menyerap warna, yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif akan tetap berwarna biru karena tetap mengikat senyawa kristal violet-iodin dan bakteri Gram negatif warnanya akan hilang oleh alkohol (Odianti, 2010).

Staphylococcus  aureus adalah kelompok bakteri dengan ciri-ciri berupa Gram-positif berbentuk bulat, biasanya tersusun dalam rangkaian tak beraturan seperti anggur. Staphylococcus aureus adalah bakteri dengan bentuk bola atau cocus dengan garis tengah sekitar 1 µm dan tersusun dalam kelompok tak beraturan. Staphylococcus aureus tidak bergerak dan tidak membentuk spora (Odianti, 2010).

Bakteri Pseudomonas memiliki karakter kunci yaitu berupa sel berbentuk basil, Gram negatif, aerob obligat, motil dan oksidasi fermentatif negatif. Bakteri Pseudomonas tergolong bakteri mesofil dengan suhu optimal 25 ⁰C – 30 ⁰C. Bakteri Pseudomonas bersifat aerob dengan ukuran yang optimal yaitu 0,5 – 0,8 µm (Puspitasari, 2012).

B.     Metode Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau dikenal dengan pengecetan Gram merupakan pengecetan diferensial yang digunakan dalam kajian bakteriologi. Pengecetan Gram memisahkan bakteri ke dalam dua kelompok, yaitu Gram negatif dan Gram positif. Larutan yang digunakan dalam teknik pewarnaan Gram yaitu antara lain kristal violet, lugol, alkohol dan safranin dengan fungsi tersendiri (Hajar, 2012).

Pengecatan Gram dilakukan dengan langkah-langkah yang sederhana yaitu, kaca objek dibersihkan dengan alkohol dan di panaskan dengan menggunakan api bunsen. Isolat yang diwarnai diambil dengan menggunakan jarum ose dan dioleskan pada kaca objek secara aseptik. Proses pewarnaan dimulai dengan meneteskan zat warna kristal violet sebagai zat warna utama, dan dibiarkan selama satu menit. Larutan lugol pada pewarnaan Gram berperan sebagai zat pengikat warna pada zat warna utama (Yulvizar, 2013). Selain itu, Pratita (2012) menjelaskan bahwa dalam pengecatan Gram digunakan larutan pencuci dengan menggunakan larutan alkohol 96 % sampai semua zat warna luntur, kemudian dicuci dengan menggunakan air, dan menggunakan larutan safranin sebagai larutan penutup.

III. METODE PRAKTIKUM

A.  Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Selasa, 04 Oktober 2016 pukul 13:30-15:30 WITA. Bertempat di Laboratorium Biologi Unit Mikrobiologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Halu Oleo, Kendari.

B.  Bahan Praktikum

Bahan yang digunakan pada praktikum ini tercantum pada Tabel 1.

Tabel 1. Bahan dan kegunaan

No.	Nama Bahan	Satuan	Kegunaan
1	2	3	4
1.	Esschericia coli, Pseudomonas dan Staphylococcus aereus	-	Sebagai isolat dalam pewarnaan Gram
2.	Akuades	mL	Sebagai larutan pencuci
	Alkohol 70%	mL	Sebagai larutan pencuci dan pensteril
3.	Safranin	mL	Sebagai cat penutup
4.	Cristal violet	mL	Sebagai cat utama pada pewarnaan Gram
5.	Larutan Lugol	mL	Sebagai larutan penguat
6.	Isolat bakteri	-	Sebagai objek pengamatan
7.	Tissue	-	Membersihkan kaca objek dan meja kerja

C.  Alat Praktikum

Alat yang digunakan pada praktikum ini tercantum pada Tabel 2.

 Tabel 2. Alat dan kegunaan

No.	Nama Alat	Jumlah	Kegunaan
1	2	3	4
1.	Pipet tetes	18	Untuk mengambil dan memindahkan larutan
2.	Ose bulat & lurus	6	Untuk mengambil dan memindahkan isolat bakteri

   

 Tabel 2. Lanjutan..

No.	Nama Alat	Jumlah	Kegunaan
1	2	3	4
3.	Kaca objek	12	Meletakkan isolat bakteri
4.	Kaca penutup objek	12	Menutup isolat bakteri yang akan diamati
5.	Lampu spirtus	3	Untuk menfiksasi dan mengeringkan objek pengamatan
6.	Botol injeksi	3	Untuk mensuspensikan isolat
7.	Mikroskop	3	Mengamati objek pengamatan
8.	Korek api	1	Untuk menyalakan lampu spirtus
9..	Gelas plastic	3	Sebagai penampung larutan ketika membilas sampel
10.	Kamera	5	Mendokumentasikan hasil pengamatan
11.	Alat tulis	-	Untuk mencatat hasil pengamatan

D.  Prosedur Kerja

Prosedur kerja yang dilakukan praktikum ini adalah sebagai berikut:

1.        Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

2.        Mengambil akuades secukupnya dan meneteskannya di atas kaca objek.

3.        Mengambil isolat bakteri dengan menggunakan ose bulat dan menghomogenkannya dengan akuades.

4.         Menfiksasi sampel di atas lampu spiritus.

5.        Meneteskan pewarna kristal violet dan membiarkannya selama 60 detik kemudian membilas dan mengeringkannya di atas api lampu spirtus.

6.        Memberikan larutan lugol dan membiarkannya selama 60 detik kemudian membilas dan mengeringkannya di atas api lampu spirtus.

7.        Meneteskan larutan alkohol selama 30 detik kemudian membilas dan mengeringkannya di atas api lampu spirtus.

8.        Meneteskan safranin dan membiarkannya selama 90 detik kemudian membilas dan mengeringkannya di atas api lampu spirtus.

9.        Mengamati di bawah mikroskop.

10.    Mendokumentasikan hasil pengamatan.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan

Hasil pengamatan pada praktikum ini yaitu tercantum dalam Tabel 3.

Tabel 3. Pengamatan Pewarnaan Gram

No.	Isolat	Sifat Gram	Literatur
1	2	3	4
1.	Staphylococcus aureus	+	+
2.	Escherichia coli	-	-
3.	Pseudomonas aerogenosa	-	-

B.   Pembahasan

Bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif merupakan kelompok bakteri yang dikelompokan berdasarkan kemampuan dinding selnya dalam menyerap zat warna. Perbedaan penyerapan zat warna tersebut dipengaruhi oleh struktur dan fisiologis dinding sel tersebut. Oleh karena itu pewarnaan Gram sering digunakan untuk membedakan kelompok bakteri. Hal ini di jelaskan oleh Hadiotomo (2013) bahwa pewarnaan Gram masih merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan bakteri.

Metode pewarnaan Gram dilakukan dengan empat tahapan utama yaitu pewarnaan dengan menggunakan pewarna kristal violet, sebagai zat warna utama. Pewarnaan dengan lugol, pewarna ini berfungsi sebagai zat yang mengikat dan menguatkan zat warna kristal violet. Pencucian dengan menggunakan larutan alkohol dan menggunakan zat warna safranin sebagai zat penutup. Proses pewarnaan Gram di awali dengan penggoresan isolat pada kaca objek menggunakan jarum ose, dan melakukan proses fiksasi. Selanjutnya pemberian warna kristal violet dan dipertahankan selama 60 detik. Hal ini dilakukan agar dinding sel dapat menyerap zat warna kristal violet. Proses selanjutnya yaitu dilakukan penambahan larutan iodin. Larutan ini berfungsi sebagai larutan pengikat atau penguat zat warna kristal violet. Masing-masing pergantian zat warna dipertahankan selama 60 detik.  Hal ini sesuai dengan yang dilakukan oleh Pratita (2012) yaitu pemberian zat warna dipertahankan selama satu menit.

Selanjutnya pencucian zat warna dengan menggunakan larutan alkohol. Tahapan ini merupakan tahapan yang menunjukan kelompok bakteri Gram positif karena bakteri yang bersifat Gram negatif zat warna pada dinding selnya luruh bersama alkohol. Alkohol pada pewarnaan Gram berfungsi sebagai larutan yang akan membedakan antara Gram positif dan Gram negatif. Hadioetomo (2013) menjelaskan bahwa penambahan larutan alkohol pada bakteri Gram positif menyebabkan, dinding sel mengalami dehidrasi, pori-pori menciut, daya rembes dinding sel dan membran menciut sehingga menyebakan kompleks warna tidak dapat keluar sehingga sel masih tetap berwarna ungu. Sedangkan pemberian alkohol pada Gram negatif menyebabkan lipid yang mengikat warna terekstrasi dari dinding sel, pori-pori mengembang sehingga menyebabkan kompleks warna keluar dari sel sehingga berubah menjadi tidak berwarna.  Pewarnaan terakhir dilakukan dengan menggunakan safranin, zat warna ini akan menyebabkan warna merah pada bakteri sehingga dikelompokan sebagai bakteri Gram negatif.

Hasil pengamatan menunjukan bahwa  bakteri Staphylococcus aureus tergolong kedalam kelompok bakteri Gram positif. Hal ini terlihat jelas bakteri Staphylococcus aureus berwarna biru keunguan setelah dilakukan pewarnaan gram. Hal ini terjadi karena Staphylococcus aureus memiliki dinding sel yang tebal sehingga dapat mempertahankan warna kristal violet. Dewi (2013) menemukan bakteri Staphylococcus aureus yang diisolasi dari susu kambing peranakan Etawa (PE) yang berwarna ungu kebiruan setelah dilakukan pewarnaan Gram.

Hasil pewarnaan Gram pada bakteri Escherichia coli dan Pseudomonas aerogenosa, menunjukan bahwa kedua jenis bakteri tersebut tergolong kedalam bakteri Gram negatif, karena setelah pewarnaan Gram terlihat berwarna merah. Hal tersebut menunjukan bahwa bakteri-bakteri tersebut menyerap zat warna safranin. Litaay (2013) yang telah melakukan pewarnaan Gram pada bakteri Pseudomonas aerogenosa dengan hasil pewarnaan yang berwarna merah yang menunujukan bahwa bakteri tersebut tergolong kedalam bakteri Gram negatif.

V. PENUTUP

A. Kesimpulan

Kesimpulan dari praktikum ini yaitu pewarnaan Gram dilakukan dengan menggunakan empat larutan utama yaitu larutan kristal violet, sebagai zat warna utama, lugol sebagai zat pengikat warna kristal violet, alkohol sebagai larutan pencuci dan larutan sarfranin sebagai larutan penutup. Pemberian larutan ini dilakukan secara berturut-turu dengan rentan waktu 60 detik kecuali pemberian  alkohol selama 15 detik. Setiap kali pergantian larutan dibersihkan dengan akuades dan dikering anginkan pada api bunsen.

B. Saran

Saran yang dapat diajukan pada praktikum ini yaitu diperlukan kritikan dan saran dari pihak manapun terutama dari asisten pembimbing demi perbaikan laporan ini.

DAFTAR PUSTAKA

Dewi, A. K., 2013, Isolasi, Identifikasi dan Uji Sensitivitas Staphylococcus aureus terhadap Amoxicillin dari Sampel Susu Kambing Peranakan Ettawa (PE) Penderita Mastitis di Wilayah Girimulyo, Kulonprogo, Yogyakarta, Jurnal Sain Veteriner, 31(02): 141-143

Hajar, D., 2012, Isolasi, Identifikasi, dan Analisis Kemampuan Degradasi Hidrokarbon Bakteri Tanah Sampel B, Cilegon, Banten, Skripsi, Universitas Indonesia, Depok.

Litaay, G. W., Nugroho, A. W., dan Yulianti, L. M., 2013, Kemampuan Pseudomonas Aeruginosa dalam Menurunkan Kandungan Fosfat Limbah Cair Rumah Sakit, Skripsi, Universitas Atma Jaya Yogyakarta, Yogyakarta.

Odianti, G. T., 2010, Uji Aktivitas Antibakteri Alfa Mangostin Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa Multiresisten Antibiotik, Skripsi, Universitas Muhammadiyah Surakarta, Surakarta.

Pratita,  M. Y. E., dan Putra, S. R., 2012, Isolasi dan Identifikasi Bakteri Termofilik dari Sumber Mata Air Panas di Songgoriti setelah Dua Hari Inkubasi, Jurnal Teknik Pomits, 1(1): 1-5

 Puspitasari, F. D., Shovitri, M., dan Kuswytasari., 2012, Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Aerob Proteolitik dari Tangki Septik, Jurnal Sains dan Seni ITS, 1(1): 1-4

Yulvizar,  C., 2013, Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik pada Rastrelliger sp., Jurnal Biospecies, 6 (2): 1-7